1965年，28岁的达斯汀·霍夫曼在外百老汇及电视台演些小角色，一次偶然的机会，导演迈克·尼科尔斯看到了正在演出话剧《第五匹之行》的霍夫曼，被他的演技所打动。在尼科尔斯的栽培下，达斯汀·霍夫曼开始走入影坛 。1967年，霍夫曼在迈克·尼科尔斯执导的《毕业生》中出演本杰明，演绎一种刚毕业的大学生步入社会时的迷茫，并凭借该片获得第22届英国电影学院奖最有前途新人主演奖、第25届美国电影金球奖最佳男主角奖，同时提名第40届奥斯卡金像奖最佳男主角奖 。1969年，与约翰·沃特合作主演了剧情片《午夜牛郎》，饰演了一个贫困潦倒的穷光蛋。1970年，凭在此片中表现提名第42届奥斯卡金像奖最佳男主角奖 。1971年，在山姆·佩金法执导的《稻草狗》中饰演一位保护家园而战的剧作家。1974年，在传记《列尼传》中饰演列尼·布鲁斯。1975年，凭借该片获得第47届奥斯卡金像奖最佳男主角奖 。1976年，在约翰·施莱辛格执导的《霹雳钻》中饰演一位逃离纳粹分子囚禁的学生。同年4月4日，主演了惊悚片《总统班底》，在里面饰演一位揭示尼克松水门事件真相的记者。1979年，达斯汀·霍夫曼与梅丽尔·斯特里普合作主演了爱情片 《克莱默夫妇》，饰演一位只知工作却忽略了家人的经纪人，凭借该片获得第52届奥斯卡金像奖最佳男主角奖和第37届美国电影金球奖最佳男主角奖，该片讲述了一个单亲家庭的孩子比利和父亲克莱默先生相依为命最后和母亲重归与好故事 。1982年，出演剧情片《杜丝先生》，饰演一个脾气暴躁的男演员，提名第55届奥斯卡金像奖最佳男主角奖，并凭借该片获得第40届美国电影金球奖最佳歌舞喜剧类男主角奖，英国金像奖男主角奖。1985年，达斯汀·霍夫曼出演了根据同名舞台剧改编的剧情片《推销员之死》 。1988年，达斯汀·霍夫曼与汤姆·克鲁斯搭档主演剧情片《雨人》，饰演一位自闭症患者雷蒙，为了演好这一角色，达斯汀·霍夫曼花了一年的时间与一位“雨人”生活，仔细观察他的神态、动作、语言 。1989年，达斯汀·霍夫曼凭此获得第61届奥斯卡金像奖最佳男主角奖 和第46届美国电影金球奖最佳男主角奖 。1990年，在警匪片《迪克·特雷西》中饰演反面人物。1991年，与罗宾·威廉姆斯、朱莉娅·罗伯茨联袂主演由斯蒂文·斯皮尔伯格执导的冒险片《虎克船长》。1995年，与蕾妮·罗素、摩根·弗里曼联手主演恐怖片《极度惊慌》，为这个角色，达斯汀·霍夫曼阅读了大量有关病毒及传染学方面的书籍 。1996年，达斯汀·霍夫曼获得英国影视学院颁发的终身成就奖 。1997年，霍夫曼主演了喜剧片《作大英雄》，并获得第70届奥斯卡金像奖最佳男主角奖 。同年出演了吕克·贝松执导、米拉·乔沃维奇主演的历史传记电影《圣女贞德》。2002年，霍夫曼同杰克·吉伦哈尔搭档主演了电影《让爱自由》。2004年，霍夫曼出演传记电影《寻找梦幻岛》扮演一位舞台剧制作人，并出演了喜剧电影《拜见岳父大人2》。2007年，达斯汀·霍夫曼和娜塔莉·波特曼主演了喜剧电影《马格瑞姆的玩具店》 。2008年，达斯汀·霍夫曼为动画片《功夫熊猫》配音 。2009年，达斯汀·霍夫曼获得法国政府颁发的“法兰西共和国艺术与文学骑士勋章” 。并凭借在《功夫熊猫》中的配音获得第36届安妮奖最佳动画电影配音奖 。2011年，霍夫曼为动画片《功夫熊猫2》配音。2012年，霍夫曼执导处女作《四重唱》。2014年，出演喜剧片《鞋匠人生》在里面扮演一位不断奋斗的鞋匠，并在乔恩·费儒执导的《落魄大厨》中饰演一位餐厅老板。2016年，霍夫曼为动画片《功夫熊猫3》配音 。