1982年在影片《预备警官》中饰警校学员姚兰兰，走上银幕，表演获得了成功。1984年在著名导演吴天明执导的影片《人生（1984）》中饰女主角刘巧珍，吴玉芳在影片中的表演质朴准确，细腻深沉，很好地刻画了人物形象，博得了观众好评。而吴玉芳因该片获得第八届《大众电影》百花奖最佳女演员奖 。1985年吴玉芳考入北京电影学院表演进修班学习，系统地掌握表演理论及表演技巧。 1987年在影片《古堡小夜曲》中饰演冷漠，高傲而又美丽的少女盛勤，表演上有了新的探索，具有一定深度 。1988年在喜剧片《合同夫妻》中饰演能干，倔强的惠妹，显示了自己在喜剧方面的表演才华。1999年在影片《女人的天空》的饰演汪明慧，合作演员巫刚、高蓓蓓。同年与周里京合作饰演《黄河人》中夏茯苓一角 。2000年在电视剧《红色康乃馨》饰演华工一角，合作演员奚美娟、李强、刘蓓 。2001年出演电视剧《一路追击》中瑞缨 。同年，出演的电视剧《涉外保姆》是一部讲述上海涉外家政服务中下岗女工故事的电视剧。吴玉芳饰演金巧云，本剧塑造了一组自尊、自立、自强不息的下岗女工形象，她们以积极健康的心态、强烈进取的意识，在用勤劳的双手创造美好生活的同时，也融入时代的潮流，开始与世界对话，重新找到自己的人生价值 。2002年，出演了三部电视剧《黑水》、《黑金》、《离婚女子驿站》，分别饰演汪一梅、刘英、梁雅妮角色。2003年出演《醉拳》梁明珠，《我是有情人》蓝绣，《冰山下的来客》茹青青。2007年，搭档奚美娟、陶虹、王志飞出演电视剧《保姆》中的朱杨美丽一角 。同年与马跃、张国庆一起出演《生死英雄》，饰演魏小荣 。2009年出演电视剧《蜗居》 ，饰演徐丽，搭档张嘉译、李念、文章等，在各地播出均获得收视冠军。同年在《重生门》中饰演大太太 。2009年，主演根据黄步千的小说《濠河人家》改编的电视电影《濠河边上的女人》。2011年在《红娘子》中饰演大太太 。在《爱的契约》中饰演钱母。在《下一个奇迹》中饰演梁母 。还在电影《倾城之泪》中饰演秦师傅，合作的为李治廷、周冬雨、窦骁、陈乔恩等。2012年与胡可、沙溢、王一楠一同出演《孩奴》 ，饰演项母一角 。在《那样芬芳》饰演张慧中 。在《泪洒女人花》中出演秋香一角 。出演《麻辣女友的幸福时光》梁英一角 。2013年，吴玉芳一共出演了五部电视剧。分别是《爱闪亮》中陈玉 ，《幸福相依》中周云英，与斯琴高娃母女情深 。《恋恋不忘》中厉芷宁一角 ，《红酒俏佳人》中赵母 ，《甜蜜都市》中刘敏 。2014年，由著名导演杨亚洲执导的都市温情剧《嘿，老头》目前正在北京紧张拍摄中。吴玉芳应杨导之邀客串剧中李小花一角 。在青春巨制《长大》中演绎一回小市民本色暴露无遗的清高女教授叶岚英 。6月，在成都参加拍摄《大爱无垠》又名《高墙花》，饰演女市长陈文娟。7月参加拍摄电视剧《许愿清单》饰演家龙妈妈吴玉娟。