1988年，15岁的蔡少芬参加TVB举办的超级模特大赛。1991年，17岁的蔡少芬参加香港小姐，获得季军。 1992年蔡少芬出演第一部电视剧《极度空灵》正式开始演艺之路。1993年蔡少芬与温兆伦等主演的古装剧《魔刀侠情》播出，这是蔡少芬首次担任女主角；1994年蔡少芬出演梁羽生经典小说《白发魔女传》同名电视剧，饰演女一号练霓裳 ；3月份，蔡少芬与周星驰、吴孟达、徐锦江等主演的古装喜剧电影《九品芝麻官之白面包青天》上映，蔡少芬饰演青楼女子如烟 。1995年蔡少芬与周星驰、朱茵、莫文蔚等主演的电影《大话西游》上映，在香港票房不佳，但8月在上海上映，后又在东北三省上映，除了1997年、1998年间的VCD热卖以外，还有电影频道的播出，《月光宝盒》和《大圣娶亲》在电视上播出并重播过多次，而这部安排在非黄金时间播出的影片却创下了黄金时间播出的收视率，蔡少芬在片中饰演铁扇公主。 1997年蔡少芬与陶大宇、欧阳震华、宣萱、吴启华等主演的电视剧 《壹号皇庭V》播出，蔡少芬饰演李彤；1998年蔡少芬与罗嘉良、陈锦鸿主演的时装剧《天地豪情》以及和吴启华、林保怡等主演的时装医务剧《妙手仁心》播出，蔡少芬分别饰演孙桦和唐姿礼，并凭借《妙手仁心》获得万千星辉颁奖典礼最佳女主角奖。 1999年蔡少芬出演香港无线电视台为庆祝香港回归制作的百集长剧《创世纪》，蔡少芬饰演田宁 ；2000年与宣萱、陈慧珊、郭可盈被称为为TVB“四大花旦”。2001年蔡少芬出演《陀枪师姐III》，饰演女一号卫英姿 。2002年，蔡少芬与马浚伟、郭羡妮主演的27集古装历史电视剧《洛神》，蔡少芬饰演传奇女子甄宓：温顺如蒲草，坚定如磐石。 2003年蔡少芬与于波、陈法蓉、张晋等主演的中国内地古装神话剧《水月洞天》播出， 蔡少芬饰演的豆豆是一个精于偷盗的江湖女贼。 2004年，蔡少芬出演《水月洞天》续集《灵镜传奇》和《陀枪师姐》续集《陀枪师姐Ⅳ》；2005年蔡少芬与焦恩俊主演的古龙小说《英雄无泪》改编而成的古装电视剧《泪痕剑》，蔡少芬饰演拥有倾城的美貌和精湛的舞技的蝶舞 ；在与于波、周海媚主演的古装魔幻神话剧《神鬼八阵图》中饰演女一号千寻 。2006年蔡少芬与赵文卓、李小冉主演的梁羽生武侠小说改编的中国大陆古装武侠剧《七剑下天山》以及和陈豪、黎姿主演的中国香港电视剧《火舞黄沙》播出，蔡少芬分别饰演飞红巾和焦玉。 2008年蔡少芬与邵美琪、黎姿等主演的都市情感剧《珠光宝气》播出，蔡少芬饰演奸角康雅思，并凭借该剧再度入围TVB万千星辉颁奖典礼最佳女主角奖和第十五届上海白玉兰奖最佳女主角奖。 2011年11月蔡少芬和孙俪、蒋欣、刘雪华、陈建斌等主演的中国内地古装宫廷剧《甄嬛传》播出，该剧于2012年3月份 在安徽卫视、上海东方卫视播出后连续一个月获得收视前两位，大结局在安徽卫视的收视率达到2.316%，剧中饰演表面温婉大度、和蔼可亲，实则“腹黑”的皇后乌拉那拉·宜修 ，凭借该角获得网络最受欢迎港台女演员奖 。2012年，蔡少芬再度出演宫廷剧《美人无泪》和《金枝欲孽2》，分别饰演博尔济吉特·哲哲和布雅穆齐·湘菱。2013年，蔡少芬在章子怡、王力宏、林心如主演的爱情电影《非常幸运》中饰演毒舌腹黑女西西。 2015年在综艺节目《奔跑吧兄弟》中担任嘉宾，与王祖蓝一组。 同年，她与丈夫张晋一同参与综艺节目《为她而战》。 2015年蔡少芬与林青霞、宁静、朱茵及其他女演员一同参与湖南卫视自制真人秀《偶像来了》。 同年11月6日参与大型综艺节目《全员加速中》担任嘉宾。 2016年3月25日，参加浙江卫视综艺《王牌对王牌》第九期。 7月，拍摄由林黎胜执导的都市时尚情感剧《海上嫁女记》，剧中饰演70后单身辣妈何念晴。 8月，出演犯罪动作电影《反贪风暴2》，演绎智慧干练的廉政公署探员王漫玲一角，该片将于9月15日上映。