2003年，17岁的周美毅便成为了广州芭蕾舞团的一名芭蕾舞演员，而她出演的舞剧《梅兰芳》则获得了第3届全国舞剧观摩演出最佳剧目奖。2004年，周美毅出演了芭蕾舞剧《梁山伯与祝英台》，此剧则获得了第4届中国舞蹈荷花奖舞剧铜奖；同年，周美毅还参加了第12届美在花城广告新星大赛,，并获得了比赛的最佳表演奖。2006年，周美毅参加了首届南方小姐选美大赛，并最终凭借不俗的表现获得了比赛的十佳选手、最具亲善奖和最受传媒欢迎奖 ；同年，周美毅还参加了深圳广电集团电视剧频道举办的“我是女主角”选拔活动，周美毅也最终获得了活动的最受观众欢迎奖和最上镜奖，并成为了深圳电视台电视剧频道的形象代言人 。2007年，周美毅开始担任深圳电视台《时尚装苑》等电视节目的主持人；随后，周美毅参加了红楼梦中人全球选秀活动，并最终一路过关斩将获得了宝钗组全国十强的成绩 ；同年，周美毅还与众多艺人共同出演了个人的首部电视剧作品《真情人生》。2008年，在经过一系列的专业训练之后，周美毅顺理成章的出演了李少红版《红楼梦》，并在剧中饰演了金陵十二钗之一的李纨 ；同年，周美毅还在与宋春丽、于小慧、李成儒等艺人合作出演的都市家庭剧《穷妈妈富妈妈》中饰演了善良纯真的80后女孩钟克敏 。 2010年，周美毅与归亚蕾、蔡飞雨、马少骅共同出演了根据真实历史事件改编的近代传奇剧《杨翠喜案》，并在剧中饰演了出身望族却命运多舛近代新女性四格格 ；随后，周美毅又在与马晓灿、林申、茹萍联袂主演的都市情感剧《给你生命给我爱》中饰演了命运坎坷却乐观坚强的女主角路桐 ；同年，周美毅还出演了个人的首部电影作品，她与陆思宇搭档主演了现代纯爱片《狠狠爱》，并在片中饰演了坚强敢爱的女主角小米 。2011年，周美毅先是与林申、李沁、王时雨合作主演了民国悬疑片《落难神偷》，周美毅在片中饰演了妖娆多姿的旧上海女明星周梦雅 ；之后，周美毅又与蒋梦婕、许绍洋、秦子越联袂主演了民国言情剧《刺青海娘》，并在剧中饰演了对好姐妹有情有义的美丽女子蔡有君 ；同年，周美毅还与张嘉倪、李沁、林申等艺人共同出演了都市纯爱剧《花开半夏》 。2012年，周美毅先是主演了根据真人事迹改编的公益温情电影《美丽心灵》，并在片中饰演了身残志坚的美丽女教师刘云 ；随后，周美毅又与俞潇春、于瑛楠、丁曼联袂主演了现代爱情片《离不了的婚》，周美毅在片中饰演了遭遇感情困扰的女主角余安安 ；同年，周美毅还与刘涛、黄觉、万妮恩合作出演了民国悬疑剧《迷局1927》，并在剧中饰演了妩媚性感却爱财如命的富家姨太太刘香菱 ；此外，周美毅还客串出演了现代家庭剧《我的左手右手》 。 2013年，周美毅先是与孙菂、丁军、周艳泓联袂主演了近代革命剧《代号麻雀》，并在剧中饰演了美艳绝伦且心机深沉的日本女间谍春花 ；之后，周美毅又与李柱贤、郑凯、米雪合作出演了都市商战剧《酒店世家》，周美毅在剧中饰演了为爱不求名分的痴情女子顾莉雅 ；同年，周美毅还在与赵文瑄、李沁、李易峰等众多艺人共同出演的现代励志剧《千金归来》中饰演了生性善良却迫于生计被人利用的多面女子赵真真 ；此外，周美毅还与严屹宽、李念、陈锦鸿合作主演了民国传奇剧《绞刑架下的春天》，并在剧中饰演了红颜薄命的美丽女子窦春宵 ；以及，与明道、李沁、胡兵共同出演了都市言情剧《如果我爱你》 。2014年，周美毅与宋茜、蒋劲夫、杨洋合作出演了年代悬疑剧《茧镇奇缘》 。2015年，周美毅与刘恩佑、吕一、何明翰等人联袂出演了抗战动作剧《大道天行》，周美毅在剧中饰演了拥有妙曼身姿和迷人的嗓音的上海滩名媛满优 。2016年，周美毅与唐嫣、罗晋、吴建豪等人合作出演了根据同名小说改编的古装宫廷传奇剧《锦绣未央》，而她则在剧中饰演了阴险毒辣且诡计频出的腹黑美人春茗 。同年，周美毅出演的电视剧《咱们相爱吧》于11月7日登陆湖南卫视金鹰剧场 。